湖北男性不孕交流组

喘可治治疗肾阳虚型少精症的实验研究

万正药业2018-07-15 10:54:45

符卓韬1 , 孟聪2 ,王志刚1丘勇超1

摘要: 目的  观察喘可治注射液对肾阳虚型少精症雄性大鼠的精子数量及致雌性大鼠受孕情况的影响。 方法24只造模成功的肾阳虚雄性大鼠随机分为空白对照组、喘可治低剂量组(2.5ml/kg·d)、喘可治高剂量组(10ml/kg·d);各组每日2pm分别给予生理盐水或不同剂量喘可治注射液腹腔注射,8pm雄性大鼠与雌性大鼠按12同笼;第二天8am观察雌性大鼠阴道涂片以判定受孕情况,连续7天。同时观察各组雄鼠的精子密度和睾丸组织学。结果致雌鼠受孕数:对照组0.63±0.71,喘可治低剂量1.11±0.93,喘可治高剂量组1.67±0.97(p<0.05);精子密度与造模前比较:对照组显著减少,喘可治低剂量组略有减少,喘可治高剂量组无明显改变;睾丸组织学评价:对照组曲精细管较空虚,其内生精细胞排列不均,生精细胞明显减少,部分缺失,精子细胞数显著减少,有的甚至出现钙盐沉积;而喘可治低、高剂量组均可见精子细胞密集,且呈剂量依赖关系。结论喘可治注射液对肾阳虚型少精症大鼠具有较好的治疗效果,可以改善睾丸功能,提高受孕率,且呈量效关系。

关键词:喘可治;肾阳虚;少精症;睾丸生精功能;怀孕

(1.广州中医药大学第一附属医院泌尿外科, 2 .广州市中医医院妇科)

 作者:符卓韬 ,硕士,研究方向:中医男科学; E-Mail 370708660@qq.com

男性不育症是一项世界性的医学和社会学问题,亦是21世纪危害人类生殖健康的重要疾病之一。据世界卫生组织估计,全球约有6千万~8千万对不育夫妇[1]。目前药物治疗或体外人工受精、单精子卵泡内注射治疗,供精人工授精成功率都偏低。通过开发中医药技术,提高受孕率是值得探索的科学课题。

喘可治注射液是一种上市多年的中药制剂,主要用于治疗哮喘症。由于该药的组成淫羊藿和巴戟天具有温补肾阳作用,因此,我们进行了该药对肾阳虚型少精症雄性大鼠的精子数量及致雌性大鼠受孕率的实验研究。 

1  材料与方法

1 .1  材料

1 .1 .1动物 SPF级雄性SD大鼠24只,体重(324.20±21.30g;雌性52只,体重(207.14±17.92g。均购自广东省医学实验动物中心,动物许可证号:0116331。饲养于广州中医药大学第一附属医院实验动物中心SPF级实验室,检疫合格后于标准条件(22-25℃,14h照明)下,食物和水自由获取。

1 .1 .2  药物喘可治注射液由广州万正药业有限公司生产,批号:13121201

1 .1 .3 喘可治注射液剂量确定采用费辛等[2]换算喘可治注射液大鼠剂量:①对照组,腹腔内注射生理盐水2.5 ml/kg· d;②喘可治低剂量组,腹腔内注射喘可治注射液2.5 ml/kg·d;③喘可治高剂量组,腹腔内注射喘可治注射液10ml/kg· d

1.1.4.实验仪器

    显微镜:OlympusIX71型倒置显微镜;BSA 1245电子天平:sartorius赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;自制大鼠游泳箱(水高约50 cm、容积为0.6 m× 0.6m×1 m 的长方形塑料箱);动物手术台;水温计。 

 

1.2.1实验动物分组

    随机将雄性大鼠随机分为空白对照组、喘可治低剂量组、喘可治高剂量组,每组8只大鼠。

1.2.2造模方法

按照谢玲玲和曹继刚等[3-4]“房事不节+游泳”所致房事不节、劳倦过度的肾阳虚模型造模。本实验造模分两个阶段:

第一阶段:共14天。每日上午9时左右将大鼠体重10%的保险丝缠绕于大鼠尾根部,造成大鼠负重状态,然后将其放入水深约50cm、容积为0.6 m×0.6m×1 m 的长方形塑料箱,水温15±1℃的水槽中游泳,以力竭为度(大鼠鼻尖没入水面10s,1次/d)。以造肾阳虚模型雄性大鼠。

第二阶段:共7天。每日上午9时左右大鼠行游泳实验;下午3时左右对照组大鼠腹腔内注射生理盐水2.5 ml/kg·d;喘可治低剂量组大鼠腹腔内注射喘可治注射液2.5 ml/kg·d;喘可治高剂量组腹腔内注射喘可治注射液10ml/kg·d;晚上8时左右雄性大鼠与雌性大鼠按1:2同笼,第二天上午8时观察雌性大鼠阴道涂片。

完成两阶段造模后处死雄性大鼠。雄鼠处死前一天自晚上8时开始禁食禁饮,次日麻醉成功后,摘取雄鼠的睾丸,固定于固定液中。

病理标本在10%中性缓冲福尔马林室温下固定24小时,梯度酒精脱水,TO生物透明剂透明,石蜡包埋,切成4 mm厚的组织片(于标本最大径线处取材两张),待用于HE染色。

1.2.3.HE染色

    将睾丸组织切片分别于TO生物透明剂脱蜡5分钟,无水乙醇洗脱TO生物透明剂1分钟,共2次,梯度酒精水化,自来水水洗2分钟,蒸馏水浸洗1分钟,苏木素染色3分钟,自来水洗一分钟,1%盐酸酒精分化10秒,自来水洗1分钟,1%稀氨水返蓝30秒,脱水、透明、封片。用Olympus I×71型倒置显微镜拍照,进行睾丸组织学评价。

2.监测指标

2.1.1阴道涂片

2.1.1.1确定妊娠:将雌鼠与雄鼠按2:1的比例于每晚8时同笼,第二天上午8时左右行阴道涂片检查,以涂片中发现精子为确立为妊娠标准。

2.1.2.雌鼠怀孕情况

比较分别与三组雄性大鼠同笼后雌鼠怀孕情况以雌鼠阴道涂片发现精子确定妊娠,计算各不同处理组别7天怀孕情况。

2.1.4.雄鼠睾丸组织学评估—参照苏宁主编的《新药毒理实验—动物组织学图谱》[5]

3  结果

3.1造模后雄鼠一般情况

实验前各组雄鼠反应灵敏、动作灵活、活动自如、状态良好,毛色新鲜富有光泽;造模第2天开始,部分腹泻,便溏;一周后雄鼠明显成群卷缩,扎堆,活动数量减少,部分老鼠毛发枯黄,脱落。两周后老鼠体重明显下降、被毛脱落、眯眼懒动,易怒、对外界刺激敏感,与谢玲玲和曹继刚等所造肾阳虚模型所出现的一般情况相似,可判定肾阳虚雄鼠模型造模成功。

 3.2各组雌鼠怀孕情况(见表1

               三组雌鼠怀孕情况比较  ± sn=8

      组别

平均怀孕数

     对照组

0.63±0.71

  喘可治低剂量组

1.11±0.93

  喘可治高剂量组

1.67±0.97

#:与对照组比较p<0.05

  1结果显示,喘可治高剂量组、低剂量组雌鼠怀孕数明显高于对照组,具有统计学意义(p<0.05);喘可治高剂量组显示出优于低剂量组的趋势。

 

3.3显微镜下精子密度比较

雌雄鼠同笼后的第二天,观察雌鼠阴道涂片精子数量情况。结果发现:对照组精子密度明显减少,喘可治低剂量组精子密度较前亦有减少,高剂量组则较前无明显改变。如下图:

     图一:高剂量组

      图二:低剂量组

     图三:对照组.


×40

(四)睾丸组织学评价

喘可治高剂量组和低剂量组的睾丸组织中可见曲精细管内不同发育阶段的生精细胞分层排列,各级生精细胞分化程度不等,高剂量组中可见精子细胞密集,低剂量组精子细胞较高剂量组减少。对照组睾丸组织可见曲精细管较空虚,其内生精细胞排列不均,生精细胞明显减少,部分缺失,精子细胞数明显少于高剂量组及低剂量组,有的甚至出现钙盐沉积。(图二)

图二各组睾丸组织评价(HE=100

 

4

    男子不育症是男科常见疾病,按照世界卫生组织最新的标准:夫妻双方在未采取任何避孕方式的前提下,同居一年以上,由于男性因素造成女性无法受孕的称为男性不育。影响男子不育的因素很多,但是精子的质量和数量是最重要的因素之一。睾丸是男子的生殖腺,睾丸曲细精管是精子产生的基地,因此睾丸性病因是引起男子不育症的最常见因素。本实验选择精子密度、睾丸生精细胞的数量及形态、致雌鼠受孕率作为指标,评价喘可治对男子不育症的作用。

     中医认为,肾与生育关系至关重要,肾气的盛衰,天睽的有无,脏腑功能的协调与否,直接决定着男子的生殖能力。《证治准绳》指出:“医之上工,因人无子,语男则主于精,男从补肾为要……”喘可治注射液的组成为淫羊藿和巴戟天,这二味药均具有补肾壮阳的功效。《神农本草经》曰:“淫羊藿,味甘,气辛,性温……主阳虚、阳痿……艰于子嗣者,皆宜服之。”现代药理研究发现淫羊藿主要化学成分为淫羊藿苷、淫羊藿多糖等具提高生殖功能之功效[6]。淫羊藿苷通过miRNA-21抗细胞凋亡从而促进胚胎发育[7];用于治疗性功能障碍[8]  。《中华人民共和国药典》:巴戟天味甘、辛、微温,具有补肾阳,强筋骨之作用,可用于治疗阳痿遗精,宫冷不孕等症。巴戟天醇提取物能增加衰老雄性大鼠附睾精子总数,活精子率,降低畸形精子率[9]。水提取物对活性氧所致的人精子过氧损伤有明显干预作用,对精子运动功能具有保护作用[10]

本实验结果显示,喘可治注射液可以显著提高肾阳虚证雄性大鼠精子密度;睾丸病理学表明喘可治组雄性大鼠睾丸的生精细胞数量及形态均优于对照组;雌鼠怀孕率得到显著提升,且呈剂量依赖关系。因此认为,喘可治对肾阳虚少精症引起的男子不育症可能具有一定的治疗作用。

[1]Baker HWG Liu DY,Bourne H,et,al. Diagnosis of apermdefectsin selectingpatients for assisted fertilization [J].Hum Reprod,1993,8(11):1779-1780.

[2]费辛,蔡宇波,曹兰芳.喘可治注射液对大鼠抗炎和免疫调节机制的研究[J].药学服务与研究,2011,11(5):333-336.

[3]谢玲玲,王萧,张永斌. “房室不节”所致肾虚证动物模型造模方法探讨[J].山西中医,2010, 2(26):46-48.

[4]曹继刚,周安方,黄琼霞,等.中医疲劳综合征大鼠模型的建立与评价[J].湖北中医杂志,2008,30(1):7-8.

 [5]苏宁,姚全胜.新药毒理实验-动物组织病理学图谱[M].南京:东南大学出版社,2005:40-41.

[6]肖培根.新编中药志[M].北京:化学工业出版社,2002:322.

[7] Shi YR,Wang ZH,Cao YC,et al.Relationshipsbetween icariin and anti-apoptotic miRNA-21 in mouse blastocyst development invitro.Journal of Integrative Agriculture 2013.12(4):663-669

[8]Xu SF ,Jin T,Lu YF,et al.Effect of Icariin onUDP-glucuronosy1-transferases in mouse Liver. Planta medica .2014,80(5):387-392);

[9]于成军,邓志华,余书勤,等。巴戟天醇提取物对大鼠精子的影响及抗自由基作用。山东医药工业,1994134):11-13

[10]林健,姜瑞钗,陈冠敏,等。巴戟天对小鼠精子畸形的心影响。海峡药学.199571)):83-84


来源:《广州中医药大学》 2013年



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