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五子衍宗丸对少弱精子症模型大鼠精子线粒体膜电位及超微结构影响

太极五子优生馆2018-06-01 17:03:04

原作者:王桐生,黄金玲,吴德玲 李庆,刘向国,胡闻


摘要


目的: 


研究五子衍宗丸对少弱精子症模型大鼠精子线粒体膜电位( MMP) 水平及线粒体超微结构的影响。


方法: 


取体重为 200 ~ 220 g 雄性 SD 大鼠 60 只,随机分成正常组,模型组,对照组( 黄精赞育胶囊组) ,五子衍宗丸低、中、高剂量组,除正常组外,其他各组大鼠灌服雷公藤多苷[30 mg / ( kg·d)],连续8周,制备少弱精子症模型。造模结束后,正常组、模型组给予等容量蒸馏水[10 ml / ( kg ·d) ],对照组给予黄精赞育胶囊溶液[3.01 g / ( kg·d) ],五子衍宗丸各组分别给予水提液,低剂量组[2.30 g 生药 / ( kg·d) ],中剂量组[4.60 g 生药 /( kg·d) ],高剂量组[9.20 g 生药 / ( kg·d) ],连续 30 d。末次给药后 30 min,采用荧光流式细胞技术( JC-1 染色)测定精子 MMP 水平( JC-1+% ) ,并通过透射电镜观察精子线粒体超微结构的改变。 


结果:


①MMP: JC-1 + % 和强度分别为: 正常组 70.80±4.92、4360±945;模型组 33.77±6.19、1 4685±496; 对照组 56.34±10.35、3277±895;五子衍宗丸低剂量组 40.80±10.40、2016±767; 中剂量组59.40±6.51、3897± 643; 高剂量组60.71±7.81、3 371±6467。造模各组大鼠精子线粒体JC-1+%及强度均明显下降,与正常组比较差异有显著性意义( P均<0.05);连续给药30d后,给药各组均能明显提高精子MMP,增加JC-1+% ,除低剂量组外,其他用药各组与模型组比较差异有显著性意义(P均<0.05)。


②精子线粒体超微结构:雷公藤造模后,精子外膜松散、变性,线粒体肿胀、大小不一、线粒体膜不完整,轴丝结构不清或出现断裂。给予五子衍宗丸30d 后,精子外膜及线粒体膜结构完整,减少线粒体肿胀,轴丝及微管结构基本正常。 


结论: 


雷公藤多苷能降低精子 MMP 水平,破坏线粒体的结构。五子衍宗丸能明显提高少弱精子症模型大鼠精子 MMP 水平,减轻精子线粒体结构损伤。保护精子线粒体结构与功能的完整是五子衍宗丸治疗少弱精子症的机制之一。


【关键词】五子衍宗丸; 少弱精子症; 线粒体膜电位; 超微结构; 大鼠


中图分类号:R321.1 文献标志码:A 文章编号:1009-3591(2013)05-0446-05


线粒体的主要功能是产生能量,为精子运动提供ATP,精子线粒体膜电位(MMP)以及结构的改变,与精子浓度、活动率、畸形率等均具有相关性,所以线粒体的功能状态是评价精子质量的一个重要指标。前期我们研究发现五子衍宗丸能明显改善少弱精子症模型大鼠精子质量,为探讨该方作用机制,本研究采用荧光染色结合流式细胞术和透射电镜观察了五子衍宗丸对精子MMP及超微结构的影响。



1 材料与方法


1.1 动物及材料


1.1.1 实验动物


雄性SD大鼠,体重200~220g,SPF级,由安徽省实验动物中心提供,许可证号:SCXK(皖)2011-002号。大鼠均自由饮水、采食。每天更换笼中的垫料并换水以保持干燥清洁。环境温度20~25℃;光照:白天12h/夜晚12 h。


1.1.2 实验药物


五子衍宗丸(枸杞子、菟丝子、五味子、车前子、覆盆子,均购自安徽济人药业有限公司,批号分别为120201和110915),剂量参考《中华人民共和国药典》2010年版中五子衍宗丸成分中各药比例计算,每剂含枸杞子16g、菟丝子16g、覆盆子8g、车前子4g、五味子2g,采用水煎浓缩成1g生药/ml 备用。雷公藤多苷片,10 mg / 片,上海复旦复华药业有限公司生产,批号:110902;黄精赞育胶囊,上海新亚药业邢江有限公司生产,0.31g/粒,批号:110901。




1.1.3 实验试剂


MMP 测定试剂盒( JC-1) ,上海碧云天生物技术有限公司生产,批号:20120605;生理盐水,安徽丰原药业股份有限公司生产,批号:20110903。PBS,武汉博士德生物工程有限公司生产,批号: AR0030。


1.1.4 实验仪器


Olympus BX60 光学显微镜,Olympus公司生产;BD FACSC antoTM Ⅱ型流式细胞仪,美国BD公司生产;LKB-NOVA型超薄切片机,瑞士DAKO公司生产;JEM-1230 型透射电镜,日本JEOL公司生产。


1.2 方法


1.2.1 动物分组及给药


取60只SD雄性大鼠,随机分成正常组、模型组、对照组[黄精赞育胶囊组,3.01g/( kg·d)],五子衍宗丸低、中、高剂量组[分别为2.30、4.60、9.20g 生药/(kg·d),按公斤体重计算相当于人用量46g生药/d的3、6、12倍]。除正常组外,模型组,对照组,五子衍宗丸低、中、高剂量组动物灌服雷公藤多苷[30mg/(kg·d),用0.5%CMC-Na制成混悬液],连续8周,造成少弱精子症模型。造模结束后各组动物按剂量灌胃给药,1ml/100g体重,连续给药30d。正常组、模型组给予等容量蒸馏水。末次给药后30 min,处死动物,摘取附睾组织,进行相关指标检查。


1.2.2 精子MMP测定


取一侧附睾放入盛有6ml已预热至37℃生理盐水的试管中,剪碎,摇匀,37℃保温15 min,使精子充分游离。将精子游出液用200目滤网过滤,反复操作至上清液变清,计数板计数,用生理盐水调整2×106/ml浓度备测。按试剂盒说明书进行操作:取精子细胞悬液0.5 ml,加入0.5mlJC-1染色工作液,混匀后于37℃孵育20min。孵育结束后600×g4℃离心4min,沉淀细胞。弃去上清液,用1mlJC-1染色缓冲液重悬细胞,按上述速度离心,沉淀细胞,弃去上清液,洗涤细胞,连续2次。于沉淀细胞中加入0.5 mlJC-1染色缓冲液重悬细胞,用流式细胞术检测50000个精子。JC-1单体和聚合物荧光信号分别在 FL1 和 FL2 探测器上获得,JC-1 聚合物(Ex = 488nm,Em = 575nm)呈红色荧光表示线粒体膜电位正常,JC-1单体(Ex = 488nm,Em = 525nm)呈绿色荧光表示MMP丧失。用发橙红色荧光精子百分率(JC-1+%)表示 MMP 正常精子的比例。




1.2.3 精子线粒体超微结构观察


取附睾头部组织切成1平方毫米的小块,立即置于2.5%的戊二醛固定液,固定4h,0.1mol/L PBS(pH 7.2)浸洗2h,1%四氧化锇固定液固定2h,乙醇梯度脱水(30%乙醇15min、50%乙醇15min),70%醋酸铀乙醇饱和液中12h,环氧树脂Epon812浸透、包埋,聚合后作半超薄切片1~2μm,亚甲蓝染色后光学显微镜下定位,用瑞典LKB-NOVA型超薄切片机进行50~70nm超薄切片,醋酸铀和柠檬铅双染色,日本JEM-1230型透镜式电子显微镜下观察附睾精子超微结构,重点观察精子尾部线粒体的改变并拍片。


1.3 统计学分析


计量资料均采用x±s表示,用SPSS 13.0软件处理,多样本之间的组间比较采用单因素方差分析,两两比较用SNK-q检验,P<0.05为有显著性差异。


2 结果


2.1 五子衍宗丸少弱精子症模型大鼠精子MMP的影响


见表1及图1。




给予雷公藤多苷30mg/(kg·d)连续8周,模型组JC-1+% 明显下降,其橙红色荧光强度也显著降低,与正常组比差异有显著性(P均<0.05) 。给药30d后,给药各组的JC-1+%和荧光强度均不同程度上升,其中五子衍宗丸中、高剂量组作用明显,与模型组比差异有显著性(P均<0.05)。



2.2 五子衍宗丸对少弱精子症模型大鼠精子线粒体超微结构影响 


见图2。



正常组精子尾部中段横切可见: 精子外膜完整,轴丝、线粒体清晰。轴丝由9对周围微管和2个中央微管组成9+2结构,轴丝外周线粒体呈环形排列。模型组精子外膜松散、变性,线粒体肿胀、大小不一、线粒体膜不完整,轴丝结构不清。对照组精子细胞出现水肿,轴丝断裂,线粒体膜完整。五子衍宗丸小剂量组精子外膜完整,线粒体轻度肿胀、轴丝结构较完整,中剂量组精子外膜较完整,线粒体轻度肿胀,轴丝结构不清,大剂量组精子外膜及线粒体膜较完整,线粒体轻度肿胀,轴丝结构完整,9 + 2 结构较明显。


3 讨论


线粒体作为细胞器,是精子运动的供能中心,其结构的完整性和功能状态直接影响精子的运动能力。线粒体通过氧化磷酸化合成 ATP,为精子的运动提供能量,在 ATP 合成过程中与线粒体内的电子传递密切相关,线粒体通过电子传递将 H + 从内膜的基质侧泵到内膜外,形成跨膜电位差。MMP 的维持对于线粒体正常功能的实现极其重要,膜电位的下降会导致 ATP 合成不足,影响细胞正常的生命活动。MMP 水平反映了精子的能量代谢水平,线粒体膜电位的丧失预示精子运动所需的能量合成出现障碍,导致精子活力下降或精子细胞凋亡与坏死。有研究表明弱精子症患者精子尾部线粒体超微结构出现异常,精子线粒体肿胀、大小不均、排列紊乱,MMP明显低于正常对照组。本研究发现雷公藤多苷造模8周后,模型动物精子线粒体结构受损,出现线粒体肿胀、轴丝断裂等现象,MMP水平显著下降,与文献报道一致,说明雷公藤导致少弱精子症与影响精子线粒体结构与功能有关。



五子衍宗丸为治疗男性不育症的经典方药,由枸杞子、菟丝子、覆盆子、五味子、车前子组成,具有添精补髓、疏利肾气、种嗣衍宗的功效,为历代医家所推崇的代表方药。大量的临床及实验研究发现:五子衍宗丸能增加精子活力及浓度,提高性激素水平,改善性功能的作用。本研究以影响精子活力的关键位点线粒体为切入点,分析了该方对线粒体超微结构及MMP的影响,结果发现五子衍宗丸能保护精子外膜及线粒体膜完整、减轻线粒体肿胀、减少轴丝断裂、抑制精子MMP的下降,避免线粒体损伤。


故推测:保护精子线粒体结构的完整、维持其功能正常是五子衍宗丸治疗少弱精子症的机制之一。


参考文献

[1]董浙清,夏文进,吴敏,等.线粒体膜电位与精子功能的关系.中国卫生检验杂志,2010,20(5):1098-1154.

[2]王秋萍,王桐生,龙子江,等.五子衍宗丸对少弱精症模型大鼠精子质量及睾丸组织的影响.中成药,2011,33(10):1796-1797.

[3]夏欣一,吴永,侯保山,等.JC-1单标法流式细胞术检测精子线粒体膜电位的研究.中华男科学杂志,2008,14(2):135-138.

[4]胡 毅,夏欣一,潘连军,等.JC-1单标法检测精索静脉曲张患者精子线粒体膜电位的研究.中华男科学杂志,2009,15(9):792-795.

[5]党连凯,陈生,巫广腾,等.不育症患者精子尾部超微结构改变的观察.生殖医学杂志,2008,17(6):469-473.

[6]孙中明,丁彩飞,颜志中,等.活精口服液对特发性弱精子症精子尾超微结构的影响. 中医杂志,2009,50( 1) : 36-38.

[7]周秀芬,姜宏,朱杰.弱精子症患者精子凋亡和线粒体膜电位等相关研究.安徽医科大学学报,2009,44(4):565-569.

[8]胡海翔,马建伟,支艳,等.不育症患者精子头部及尾部超微结构的研究.中国男科学杂志,2006,20(5):23-25.

[9]李轩,白勇,钟树怀,等.五子衍宗丸对不育患者附睾功能和精子活力的影响.光明中医,2009,24 ( 7 ) : 1222-1223.

[10]葛争艳,金龙,刘建勋.五子衍宗丸补肾壮阳作用的实验研究.中国实验方剂学杂志,2010,16(7):173-176.

[11]徐计秀,徐宁,高国,等.生精片加五子衍宗丸改善精液质量和睾酮水平的研究.中国男科学杂志,2010,24(11):50-52.

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